[Параметры] [Интерфейс] [Работа с письмами] [Ошибки]
(01) (02) (03) (04) (05) (06) (07) (08) (09) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34) (35) (36) (37) (38) (39) (40) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) (49) (50) (51) (52) (53) (54) (55) (56) (57) (58) (59) (60) (61) (62) (63) (64) (65) (66) (67) (68) (69) (70) (71) (72) (73) (74) (75) (76) (77) (78) (79) (80) (81) (82) (83) (84) (85) (86) (87) (88) (89) (90) (91) (92) (93) (94)

НАОЧЕРЕДИ - РАСШИФРОВКА ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА

Достижение века: после восьми лет работы многихисследовательских групп удалось точноопределить 97 миллионов пар нуклеотидов и ихместонахождение в спирали ДНК, хранящей полнуюнаследственную информацию микроскопическогочервячка
Сaenorhabditis elegans.


С самых древних времен люди задумывались надвопросом о том, как особенности живых организмовпередаются их потомкам. Разрабатывались самыеразные теории, иногда очень остроумные и непротиворечащие многим фактам, но по-настоящемуматериальные основы наследственности началипроясняться лишь 45 лет назад, когда Дж. Уотсон и Ф.Крик расшифровали строение ДНК. Оказалось, что вэтой скрученной двойным жгутом гигантскоймолекуле записаны все признаки организма.

Каждая прядь молекулы ДНК представляет собойцепочку из четырех типов звеньев - нуклеотидов,повторяющихся в разном порядке. Нуклеотидыобычно считают парами, как сапоги или перчатки,потому что в молекуле ДНК две цепочки и ихнуклеотиды соединены поперечными связямипопарно. Четыре сорта нуклеотидов, четыре"буквы" позволяют записать генетический"текст", который прочитывается механизмомсинтеза белка в живой клетке. Группа из трехстоящих подряд нуклеотидов, действуя черездовольно сложный передаточный механизм,заставляет рибосому - внутриклеточную частичку,занимающуюся синтезом белков, - подхватывать изцитоплазмы определенную аминокислоту, следующиетри нуклеотида через посредников "диктуют"рибосоме, какую аминокислоту ставить в цепочкубелка на следующее место, и так постепеннополучается молекула белка. А белки - не толькоосновной строительный материал живогоорганизма: многие из них - ферменты - управляютпроцессами в клетке. Так что информации,записанной в ДНК тройками пар нуклеотидов,достаточно для построения нового организма совсеми его особенностями.

Еще задолго до открытия всех этих (и многихдругих) молекулярных тонкостей, изучая передачунаследственных признаков при скрещивании,биологи поняли, что каждый признак определяетсяотдельной частицей, которую назвали геном.Удалось понять, что гены лежат в ядре клетки, вхромосомах. А после открытия роли ДНК и механизмасинтеза белков стало ясно, что ген - это участокцепочки ДНК, на котором записано строениемолекулы определенного белка. В некоторых генахвсего 800 пар нуклеотидов, вдругих - около миллиона. У человека около 80-90тысяч генов. Набор генов, присущий организму,называется его геномом.

В последние годы зародилась новая отрасльгенетики - геномика, изучающая не отдельные гены,а целые геномы. Достижения молекулярной биологиии генной инженерии дали человеку возможностьчитать генетические тексты - сначала вирусов,бактерий, дрожжевых грибков. А сейчас впервыеудалось полностью прочитать геноммногоклеточного животного - обитающего в почвемикроскопического червячка длиной околомиллиметра. В лабораториях мира полным ходомидет расшифровка генома человека. Этамеждународная программа была начата в 1989 году,тогда же благодаря инициативе и энергиивыдающегося биолога, ныне покойного академика А.А. Баева, к программе подключилась и Россия. Вфеврале этого года в Черноголовке под Москвойпрошла конференция "Геном человека-99",посвященная десятилетию начала этих работ ипамяти их инициатора, руководившего российскойчастью программы первые пять лет. Сейчас в разныхстранах мира, в лабораториях,разделивших между собой "фронт работ" (всегонадо прочитать около трех миллиардов парнуклеотидов), ежедневно расшифровывается болеемиллиона нуклеотидных пар, причем темп работ всеускоряется.

Об успехах и перспективах геномикирассказывает публикуемая статья.



Член-корреспондент Российскойакадемии наук Л. КИСЕЛЕВ,
председатель Научного совета Российскойнациональной программы "Геном человека"
Министерства науки и технологий России.



Как это было


Биология, по всеобщему признанию, заняладоминирующее положение среди естественных наукво второй половине уходящего века. В конце 1998года эта точка зрения получила новое мощноеподтверждение: завершена восьмилет няя работа порасшифровке строения генома (совокупности генови межгенных участков) многоклеточного животного,круглого червя, нематоды, имеющего латинскоеназвание Caenorhabditis elegans.

Хотя это очень маленький червь, скореечервячок, с него без всякого преувеличенияначинается новая эра в биологии. Геном этойнематоды состоит из 97 миллионов пар нуклеотидовДНК, округленно 0,1 миллиарда пар. Геном человека,согласно большинству оценок, - 3 миллиардануклеотидных пар. Разница в 30 раз. Однако именноэта работа, о которой идет речь, окончательноубедила даже самых закоренелых скептиков, чторасшифровка строения всего генома человека нетолько возможна, но и достижима в ближайшие годы.

Расшифровка, или, как говорят биологи,секвенирование, генома C. elegans была осуществленапо совместному проекту двумя исследовательскимигруппами: из Центра геномного секвенированияВашингтонского университета (США) иСенгеровского центра (Кембридж, Англия). Вжурнале "Science" от 11 декабря 1998 годаопубликована серия статей, подробнорассказывающая об этой поистине грандиознойработе. Число авторов этой работы столь велико,что журнал не опубликовал списка, отославчитателей к Internet, а авторов назвал просто"Консорциум секвенаторов C. elegans". Это,вероятно, первый случай в истории науки, когдаоткрытие с самого начала и с согласия авторов какбы становится анонимным. Эту работу можно сполным правом считать знаковой, символизирующей"индустриальную" науку. Зримый символсовременной науки, где огромные финансовыевложения, роботизация, автоматизация,менеджмент, дисциплина, координация игралиопределяющую роль, оттеснив на этом этапе рольинтеллекта и творческой изобретательностиотдельных участников проекта.

Будет справедливым напомнить о том, кто первымобратил внимание на C. elegans как на объектисследования. В середине 1960-х годов СиднейБреннер, выдающийся молекулярный генетик,внесший огромный вклад в изучение генетическогокода, работал в знаменитой лабораториимолекулярной биологии в Кембридже в Англии (в нейтрудились нобелевские лауреаты Ф. Крик, Дж.Кендрю, М. Перутц, А. Клуг и другие знаменитыеисследователи). После работы над кодом С. Бреннеррешил посвятить себя изучению нервной системы ипутей ее возникновения и формирования. Онобратил внимание на малюсенького червя (C. elegans),состоящего всего из 959 клеток, из которых 302нейроны, нервные клетки. Замечательным свойствомнематоды была ее прозрачность: можно следить заповедением и судьбой каждой отдельной клетки!Сидней Бреннер привлек в свою "нематодную"лабораторию талантливых молодых исследователей,сделавших немало важных открытий. Многие из нихстали "мотором" проекта секвенирования,который был реализован в Сенгеровском центре.

Естественно, расшифровать геном такихгигантских размеров, как у названной нематоды(напомню: 97 миллионов пар нуклеотидов ДНК),невозможно без огромной подготовительнойработы. Ее в основном завершили к 1989 году. Преждевсего была построена физическая карта всегогенома нематоды. Физическая карта представляетсобой небольшие участки ДНК известной структуры(маркеры), расположенные на определенныхрасстояниях один от другого.

И вот с 1990 года началось само секвенирование.Его темп составлял в 1992 году 1 миллион парнуклеотидов в год. Если бы такой темп сохранился,на расшифровку всего генома понадобилось быпочти 100 лет! Ускорить работы удалось простейшимспособом - число исследователей в каждом центревозросло примерно до 10 Люди и аппараты работаликруглосуточно, производительность каждой машиныбыла увеличена за счет большего числа дорожек, накоторых секвенировали фрагментыДНК.

По мере того, как раскрывалась нуклеотиднаяпоследовательность ДНК C. elegans, пришлосьрасстаться с двумя заблуждениями. Во-первых,оказалось, что генов у нее не 15 тысяч, какпредполагали вначале, а 1909 Во-вторых, надежда нато, что гены сосредоточены в середине хромосом, ак концам сильно редеют, оправдалась лишь отчасти,гены распределены вдоль хромосом относительноравномерно, хотя в центральной части их все-такибольше.

Если у дрожжей функция половины генов в геноменеизвестна (так называемые молчащие гены), то учервя эта доля еще больше: из 19 тысяч генов 12тысяч остаются пока загадочными.

Два исследовательских центра, решившиегигантскую по сложности задачу, приобрелиуникальный опыт - и в ходе получения самихрезультатов, и в ходе их осмысления, хранения ипереработки. Поэтому неудивительно, что обегруппы недавно заявили, что они готовы раскрытьструктуру половины генома человека, то естьвыполнить работу в 15 раз большую по объему, чемто, что было сделано на геноме червя. И этореально. Приведу такие цифры. Сейчас во всем мирев день расшифровывается более 1 миллиона парнуклеотидов - столько, сколько за весь 1992 год.Скорость возросла в 365 раз!

Значение секвенирования генома нематоды,конечно, выходит далеко за рамки того, что можноназвать полигоном для расшифровки геномачеловека. C. elegans - первый многоклеточный организм,геном которого раскрыт практически полностью.Можно напомнить: два года назад был расшифрованпервый геном эукариотического организма -дрожжей, то есть организма, клетки которогосодержат оформленные ядра. (К эукариотамотносятся все высшие животные и растения, а такжеодноклеточные и многоклеточные водоросли, грибыи простейшие. Дрожжи, согласно биологическойсистематике, относятся к одноклеточным грибам.)Иначе говоря, за два года был пройден путь отгенома одноклеточного до генома многоклеточногоорганизма. Биологи знают, это гигантскаядистанция на лестнице эволюции и, следовательно,на пути усложнения геномов. Поразительно, как невероятно быстро пройден этотпуть!

Сравнивая теперь геномы бактерий (известно ужеболее 20 геномов) с геномами дрожжей и нематоды,биологи-эволюционисты имеют уникальнуювозможность сравнивать не отдельные гены и дажене генные ансамбли, а целиком геномы - такойвозможности в биологии еще десять лет назадпросто не существовало, об этом только мечтали. Вближайшие месяцы, когда полученные огромныеобъемы информации начнут осваивать иосмысливать, следует ждать появленияпринципиально новых концепций в теории биологической эволюции.

Новые данные и перспективыбиологии

Каковы же ближайшие перспективы, открывающиесясейчас в биологии? Вот самые очевидные. Учеловека только в пять раз больше генов, чем унематоды. Следовательно, по крайней мере около 20%генома человека должно иметь родственниковсреди известных теперь генов C. elegans. Это вгромадной степени облегчает поиск новых геновчеловека. Функции еще не известных геновнематоды изучать несравненно легче, чеманалогичные гены у человека. Гены червя можнолегко изменить (мутировать), одновременно следяза изменениями структуры гена и свойстворганизма. Таким путем можно выявлятьбиологическую роль генных продуктов (то естьбелков) у червя, а затем экстраполировать этиданные на другие организмы, в первую очередь начеловека. А можно угнетать активность генов(например, с помощью особых молекулспецифических РНК) и следить, как меняетсяповедение организма. Этот путь тоже раскрываетфункции неизвестных генов и, разумеется,сильнейшим образом повлияет на изучение геномачеловека и других высших организмов.

Биологов всегда интригует вопрос: какрегулируется работа генов? Хотя мы знаем об этомочень много, наши знания получены в основном наотдельных генах, а потому не дают цельной картинырегуляции работы всего генома как единогоцелого. Сейчас бурно развивается техника такназываемых биочипов (по аналогии с микрочипами вкибернетике). Это маленькие пластинки, на которыес помощью прецизионных приборов в тысячи точек,на строго фиксированных расстояниях одна отдругой, наносят микроскопические количествафрагментов ДНК.

Такой микрочип может, например, содержать все19000 генов нематоды - по одному гену в каждой точке,и его можно использовать для того, чтобыопределить, какие гены работают в данной клеткечервя, а какие молчат. Разумеется, здесь возможноиспользовать клетки на любой стадии развития ииз любой части тела червя. В результатеисследователь получит информацию офункциональном состоянии всех генов любойклетки на любой стадии развития червя. Опыты уженачаты, есть все основания не сомневаться, чтоеще в текущем году мы узнаем о первыхрезультатах. Это будет действительнореволюционным прорывом для биологии развития.Помимо совершенной микротехники эти опытытребуют и совершенных компьютерных программ,чтобы полученные фактические данные можно былоосмыслить и интерпретировать.

Методика биочипов открывает новую стратегию врешении одной из сложнейших в биологии проблем -проблемы взаимосвязи сигнальных регуляторныхпутей. Основная трудность заключается в том, чтовзаимодействие белковых продуктов многих геновпроисходит одновременно, причем комбинациибелков меняются не только во времени, но и вклеточном пространстве. В результате изучениеотдельных генов и их продуктов (что в основномделалось до сих пор) нередко было неэффективным.

Каково соотношение областей в геноме C. elegans,кодирующих синтез белков (экзоны) и не кодирующих(интроны)? Компьютерный анализ показывает, чтоэкзоны и интроны занимают в геноме нематодыпримерно равные доли (27 и 26%), остальное (47%)приходится на повторы, на межгенные участки и т.д., то есть на ДНК с неизвестными науке функциями.

Если сравнить по этим данным дрожжевой геном игеном человека, то станет очевидным, что в ходеэволюции доля кодирующих участков в расчете навесь геном резко уменьшается: у дрожжей она оченьвысока, а у человека очень мала. Об этом зналисравнительно давно, но сейчас названныесоотношения приобрели не только количественнуюмеру, но и структурную основу. Мы приходим, напервый взгляд, к достаточно парадоксальномувыводу. Эволюция у эукариот от низших форм квысшим сопряжена с "разбавлением" генома -на единицу длины ДНК приходится все меньшеинформации о структуре белков и РНК и все большеинформации "ни о чем", то есть для наснепонятной, непрочитанной.

Это одна из больших загадок биологическойэволюции. По поводу "лишней" ДНК существуютсамые разные предположения, зачастую прямопротивоположные по смыслу. Много лет назад Ф.Крик, один из отцов двойной спирали ДНК, назвалэту "лишнюю" ДНК "эгоистической", или"мусорной". Он считал ее издержкой эволюции,накапливающейся в геноме в результате неполногосовершенства генетических процессов,"балластом", платой за совершенствоостальной части генома. Возможно, что некотораянебольшая "эгоистическая" доля в ДНКчеловека и других высших организмовдействительно относится к такому типу. Однакотеперь стало ясно, что основная доля"эгоистической" ДНК сохраняется в эволюциии даже увеличивается, потому что она дает ееобладателям эволюционные преимущества.

Классическим примером "эгоистической" ДНКслужат так называемые короткие повторы участковДНК (Alu-элементы, альфа-сателлитные ДНК и другие).Как выяснилось в последние годы, их структураабсолютно консервативна, то есть мутации,нарушающие "правила", установленныеприродой для этих элементов, не сохраняются, они"отбрасываются" отбором. Структурноепостоянство - мощный аргумент в пользу идеи о том,что такие участки являются отнюдь не"эгоистическими", а это очень важная частьДНК для жизни вида. Другое дело, что мы еще незнаем, в чем конкретно состоит ее биологическаяроль.

Геномика человека и будущеечеловечества

Сегодня почти каждый день широкая пресса США изападноевропейских стран сообщает о все новых иновых генах человека и об их функциях или связи стеми или иными заболеваниями. В 1998 годуправительство США истратило на проект поизучению генома человека 300 миллионов долларов, ачастные компании, прежде всегобиотехнологические, - даже больше этой суммы. Покрайней мере 20 самых развитых стран мира имеютсвои национальные программы по изучению геномачеловека.

Сейчас геномная программа уже доказала своевыдающееся значение для развития наших знаний ожизни в целом. Интересно вспомнить, как эти идеибыли встречены в момент их первоначальногообсуждения и создания программы. Научноесообщество тогда разделилось на две части: однавстретила идею геномной программы с энтузиазмом,тогда как другая - со скепсисом, недоверием иподозрительностью. Средиэтой второй группы были и выдающиеся ученые,например, лауреат Нобелевской премии ДэвидБалтимор, один из отцов обратной транскрипции.Основное возражение противников: созданиегеномной программы направлено на
то, чтобы привлечь большие финансовые средства (итем самым отобрать их у других направленийбиологии), а не получить новые знания.

Истекшие 10 лет показали, что новый уровеньпонимания биологических проблем, сложившийсяблагодаря результатам геномных исследований,уже сейчас с лихвой оправдал все организационныеусилия и финансовые вложения. Более того, сталоясно, что добытая информация не могла бытьполучена простой поддержкой сотен отдельныхисследовательских групп, даже высококвалифицированных и хорошо оснащенных. Но вместе с темтеперь мы понимаем, что 10 лет назад трудно былооценить глубину и широту влияния геномики(области биологии, изучающей геномы) человека набиологию в целом.

Один из сильных аргументов против геномнойпрограммы состоял также в том, что"индустриализация" биологии приведет кутрате ее творческого потенциала, исчезновению"малой" биологии - небольшихисследовательских групп, возглавляемыхталантливыми, оригинально мыслящимиисследователями, которые не захотят пойтиработать на "фабрики секвенирования ДНК".Среди ученых, придерживавшихся таких взглядов,был, например, и Брюс Олбертс, нынешний президентНациональной академии США.

Безусловно справедливо, что одно из основныхзвеньев геномной программы - секвенирование,которое в столь гигантском масштабе достижимотолько индустриальными методами. Однако самодостижение этой фазы требовало большихинтеллектуальных усилий, новой приборной базы,новых методов, новых инструментов исследования.Здесь требовалось творческое усилие отдельныхученых. И это творческое начало как необходимыйкомпонент индустриализации было недооценен оскептиками.

Разработанные в геномике человека идеи иметоды имеют универсальное значение и применимыдля решения огромного круга биологическихпроблем, далеко отстоящих от собственно геномачеловека. Напомним только о некоторых из них.

Для картирования генома (обязательная стадияисследований, предшествующая секвенированию)разработаны высокоэффективные техники, такие,как радиационные гибриды (коллекции клеток, вкоторых удалены разные небольшие фрагментыкаждой из хромосом), или искусственные дрожжевыехромосомы, содержащие огромные фрагментыхромосом человека, бактериальные и фаговыевекторы, позволяющие размножить (клонировать)фрагменты ДНК человека...Новые техники в совокупности позволилипостроить детальную карту генома человека,которая к концу 1998 года содержала более 30 тысячмаркеров, создававших детальную карту генома.

Быстро прогрессировала техника секвенирования(например, многоканальный капиллярныйэлектрофорез резко ускорил и удешевилрасшифровку первичной структуры ДНК), созданыкомпьютерные программы, позволяющие находитьгены в расшифрованных участках ДНК.

Важно подчеркнуть, что вся эта приборная база иметодология в полной мере может применяться клюбым геномам, от бактерий досельскохозяйственных животных и растений.

Пожалуй, от развития геномики человека внастоящее время выиграла больше всегомикробиология, поскольку уже расшифровано более20 полных геномов, в том числе возбудителей многихопасных болезней (туберкулеза, сыпного тифа, язвыжелудка и других). Можно с уверенностьюутверждать, что без геномного проекта эти данныебыли бы получены гораздо позже и, вероятно, вгораздо меньшем объеме. Знание геномнойструктуры патогенных бактерий очень важно длясоздания вакцин (причем рациональносконструированных), для диагностики и другихмедицинских целей. Велико влияние геномики и намедицинскую генетику, которая занимаетсягенодиагностикой наследственных болезней,генетическими основами предрасположенности комногим распространенным болезням.

Частные компании, кредитовавшие проект,получили тысячи патентов на новые гены,фрагменты ДНК, новые методики и
т. д. Это имеет как бы двойной эффект. С однойстороны, геномика получает мощныйдополнительный импульс к развитию, а с другой -коммерциализация геномики ведет к тому, чтомногое из полученной информации фирмызасекречивают, особенно по геномикемикроорганизмов, заставляя и некоторых ученыхпоступать аналогичным образом.

Геномные методы идентификации личности,разработанные и практически реализованные вгеномике человека, имеют далеко идущиепоследствия для общества. Действительно,криминалистика получила в свое распоряжениеабсолютно надежный метод доказательствавиновности или невиновности человека. Для такогогеномного анализа (его часто называют геномнойдактилоскопией) достаточно одной капли крови,одного волоса, кусочка ногтя, следов пота, спермы,слюны, перхоти и т. д. Сегодня в мире тысячи людейосуждены или оправданы только на основаниигеномного анализа. Идентификация родственныхсвязей людей решает сейчас проблемы отцовства иматеринства, проблемы наследования прав иимущества между родственниками и неродственниками, если эти вопросы возникают.

Огромный интерес вызывает вторжение геномики висторию человечества, этнографию, лингвистику идругие области гуманитарного знания. В этуорбиту уже вовлечены и такие биологическиенауки, как антропология и палеонтология, теорияэволюции. Многие спорные вопросы историицивилизаций в древние времена будут, скореевсего, решены не историками, а геномоведами.Например, уже сейчас ясно (хотя эти работыначались совсем недавно), что происхождение имиграцию многих народов в мире (и, конечно, в томчисле в России) легче всего будет проследить по геномным маркерам, которые даютколичественную и однозначную информацию.

Программа "Геном человека", как ужеговорилось, - программа общечеловеческая. Каждаялаборатория, в какой бы стране она ни находилась,вносит в нее посильный вклад. И как только кому-тоудается раскрыть структуру нового гена, этаинформация немедленно поступает в Международныйбанк данных, доступный каждому исследователю.Без преувеличения надо сказать, что развитиеинформатики играет поистине огромную роль вуспехе мировой геномной программы.

В России по этой программе работают около 100исследовательских групп. Есть оригинальныеработы, получившие международное признание(только в прошлом году участники программыопубликовали более 70 статей в международныхжурналах). Первые пять лет главным в программебыло картирование, иначе говоря - расстановка"опознавательных значков", попытка понять:где, в какой части хромосомы ученые находятся -подобно тому, как географы прошлого составлялипервые карты Земли.

Теперь акцент сместился, и исследователипытаются уже определить функции отдельных генов.Это переход от "индустриальной науки",требующей прежде всего оборудования, к наукеинтеллектуальной. И на этом этапе мы надеемсяпреуспеть. "Массовое производство" было намнедоступно прежде всего из-за недостаткафинансирования, а кроме того - русские ученыеникогда не любили механическую работу.



Оглядываясь на 10 лет назад, можно увидеть, чтозначение геномики было недооценено, а ее влияниеоказалось гораздо шире и глубже, чем ожидалось.Ясно также, что создание геномного проекта былоогромным достижением для биологов всего мира,так как впервые поставило биологию в ряд технаук, которые способны реализовать глобальныепроекты с огромным не только общенаучным, но ипрактическим выходом. Сравнивая геномный проектс проектом освоения космического пространства(программа полетов к Луне и Марсу, программаоколоземных станций), видно, что биологическаяпрограмма, будучи во много раз дешевле, по своемувлиянию на жизнь людей не тольконе уступает, но и в конечном итоге, безусловно,превзойдет достижения космических программ,поскольку окажет влияние в XXI веке почти накаждого жителя Земли.






Так выглядит при сильном увеличении героиняграндиозного эксперимента - нематода С. elegans. Ее истинная величина -1мм.
Просматриваются фрагменты расшифровки строениягенома.



Сотрудники Сенгеровского центра в Кембридже,принимавшие участие в расшифровке генома C. elegans.
На рисунке показано строение C. elegans:1 - так называемый желудочек, 2 - тонкий отдел кишечника, 3 - яичник, 4- яйца.


Машины, применявшиеся для секвенированиягенома С. elegans.



(01) (02) (03) (04) (05) (06) (07) (08) (09) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34) (35) (36) (37) (38) (39) (40) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) (49) (50) (51) (52) (53) (54) (55) (56) (57) (58) (59) (60) (61) (62) (63) (64) (65) (66) (67) (68) (69) (70) (71) (72) (73) (74) (75) (76) (77) (78) (79) (80) (81) (82) (83) (84) (85) (86) (87) (88) (89) (90) (91) (92) (93) (94)